Úvod

Ve vývoji nervového systému se definují tři relativně oddělená stádia – proliferace, migrace a maturace neuronů. Nové neuroblasty pro šedou hmotu se v raném vývoji centrálního nervového systému (CNS) generují v zóně proliferace, která se nachází při centrálním kanálu nervové trubice. Struktury šedé hmoty jednotlivých oddílů CNS se pak vytvářejí přemisťováním těchto neuronů do svých pozic. Samotná kůra velkého mozku se konstituuje v šesti buněčných vrstvách. Neurony migrují trojím způsobem – i) radiálně, tj. od centrálního kanálu směrem k povrchu mozku; ii) tangenciálně, tj. paralelně s povrchem mozku; a iii) řetězově, kdy putují jakýmsi tunelem vytvořeným glií ze zóny proliferace do oblasti čichového bulbu a rostrálních částí hemisfér.

Buněčná migrace

Migrace neuronů začíná vznikem hrbolku a vytvořením tzv. adhezní destičky v místě jejich budoucího migračního pólu. Zde se buněčná membrána těsně přimkne k mezibuněčné hmotě, podél níž se dočasnými adhezemi postupně přemisťuje ke svému budoucímu cíli. Za migračním pólem se následně přelévá cytoplazma s buněčným jádrem (nukleokineze). Membrána se pak vymaňuje z adhezí, které se mezitím ocitly na zádi. To se děje opakovaně, dokud se neuron nedostane do místa svého určení.

Tvorbu adhezní destičky a protruzi membrány v místě budoucího buněčného vedoucího pólu indukují extracelulární faktory. Z cytoplazmatické strany buněčné membrány ji pravděpodobně ovládají hlavně aktinová mikrofilamenta. Jejich přestavbu (polymeraci a reorganizaci) řídí zejména malé GTPázy rodiny Rho, zatímco pohyby už vytvořených aktinových filament ponejvíce závisejí na jednotkách myosinu.

Přelévání cytoplazmy a nukleokineze v druhé fázi buněčné migrace už probíhá s účastí mikrotubulů, jejichž dynamika závisí na jejich agregaci a rozpadu a také na spolupráci s hybnými proteiny kinesinem, dyneinem, dynektinem a dalšími.

Radiální migrace

Radiální migrace je ze všech tří typů migrace nejvíce zřetelná a zřejmě se týká největšího počtu neuronů. Buňky při ní sledují neuroepiteliální anebo gliová vlákna napjatá radiálně od centrálního kanálu směrem k povrchu mozku. Proto se tato migrace také označuje jako gliofilní. Buňky postupují orientované svým budoucím dendritickým pólem dopředu.

V nervové tkáni tímto procesem vznikají tři primární koncentrické zóny – vnitřní ependymová (germinální, ventrikulární) zóna, plášťová mezivrstva a vnější (marginální) zóna. Ependymová zóna v budoucnu vyzraje ve výstelku komorového systému CNS. Plášťová mezivrstva, která obsahuje buněčná těla neuronů, se stane základem šedé hmoty. Marginální zóna bílé hmoty vytvoří povrchovou obálku plášťové šedé hmoty, v níž povedou výběžky nervových buněk, které sem později prorostou z plášťové mezivrstvy, jak je popsáno níže.

V místech budoucích hemisfér mozku a mozečku je vývoj dosti složitý. Neurony zde při svém radiálním postupu vycestovávají z plášťové mezivrstvy více k povrchu, do vnější marginální zóny, a spolu s marginálními elementy vytvoří ve tkáni tzv. pre-ploténku. Další vlna neuronů, která pronikne do pre-ploténky, v ní zaujme její střední část a začne konstituovat tzv. korovou ploténku. Ta rozštěpí pre-ploténku na i) vlastní zevní marginální vrstvu a ii) vnitřní sub-ploténku. Zatímco vlastní marginální vrstva se v budoucnu bude konstituovat jako vrstva I definitivní šedé kůry a povrchu mozku, sub-ploténka bude odpovídat definitivní vrstvě VI (přesněji vrstvě VIb) a ohraničí tvořící se kůru proti plášťové mezivrstvě. Následné do embryonální korové ploténky přicházejí další vlny buněk, takže nakonec vznikne komplikovaná, do dalších vrstev dělená struktura kúry mozku a mozečku.

Ukládání budoucích vrstev kůry v zóně korové ploténky má své zvláštnosti. Mladší radiální vlny neuronů vždy prostupují skrze vrstvy už přítomných, usedlých neuronů až k samému povrchu, pod definitivní zevní marginální vrstvu. Jinak řečeno, že buňky nových vln ponechávají neurony, které sem dorazily v dřívějších vlnách, vespod, v hlubších vrstvách kůry. Shora dolů se tak postupně ukládají vrstvy II-V (popřípadě ještě vrstva VIa) budoucí kůry, přičemž nejmladší vrstvy se vždy vytvářejí nejblíže povrchu. Toto uspořádání se označuje „vnitřním navenek“ („inside-out“). Obdobný proces lze pozorovat při vývoji kůry mozečku a také některých vrstevnatých struktur šedé hmoty uložených intraparenchymálně v centrálním nervovém systému.

Tangenciální migrace

Tangenciální migrace může dosahovat různého stupně, ale pravděpodobně se týká jen některých skupin neuronů. Zahrnuje například populace GABA-ergních neuronů kůry anebo nervové buňky zevní granulární vrstvy kůry cerebella. Na rozdíl od situace u radiální migrace se v tomto případě vytváří vedoucí buněčnou protruzí axonový hrbolek, který se orientuje kolmo na radiální vlákna.

Buňky migrující tangenciálně se často těsně přikládají k sousedním neuronům, a proto se tato migrace také nazývá neuronofilní.

Laboratorní myši „vrávoralky“ (reeler)

Uložení jednotlivých neuronů do určité vývojové vrstvy představuje jeden z klíčových momentů vývoje šedé mozkové kůry. Molekulární výzkum nervové tkáně dovolil částečně poodhalit mechanismy migrace neuronů. Už více než 50 let se studuje abnormální vývoj mozku způsobený mutací genu označovaného reeler, jehož fyziologickým produktem je protein zvaný reelin (to reel ve smyslu potácet se, motat se, vrávorat). U myší reeler (myší s nefunkčním genem reeler), které snad lze podle ataktických fenotypových projevů česky nazývat myši „vrávoralky“, chybí v nervové tkáni fyziologický produkt reelin.

Histopatologická vyšetření ukázala, že v mozcích myší „vrávoralek“ probíhá radiální migrace neuronů pouze do svých preterminálních fází, v nichž se vytváří pre-ploténka. V následujících stupních však nedojde k očekávanému štěpení pre-ploténky na definitivní marginální zónu a sub-ploténku. Nové vlny neuronů docestují až k pre-ploténce, nemohou jí však proniknout, takže se postupně ukládají shora dolů v patologickém pořadí vrstev V-II, a tak už zůstanou. Namísto normálního uložení vrstev „vnitřním navenek“ tak vzniká abnormální uspořádání „zevním dovnitř“ („outside-in“).

Reelin

Protein reelin je po chemické stránce glykoprotein a má typické znaky proteinů mozkové mezibuněčné hmoty. Produkují ho hlavně specializované druhy buněk usazené v embryonální marginální (zcela vnější) zóně povrchu budoucího neokortexu a hippokampu (zejména tzv. Cajalovy-Retziusovy buňky), dále granulární buňky v cerebellu a také některé neurony porůznu se nacházející v jednotlivých etážích centrálního nervového systému včetně míchy.

Mnohé z těchto buněk zřejmě před narozením nebo záhy po něm zanikají (jako např. Cajalovy-Retziusovy buňky). V dospělém mozku jsou přítomny jen v omezeném počtu, nebo alespoň přestávají exprimovat reelinovou mRNA, ale exprese reelinu se přesunuje do jiných buněk. V dospělém mozku například syntetizuje reelin zvláštní skupina GABA-ergních neuronů rozesetých v hlubších vrstvách neokortexu a v kůře hippokampu. Reelin tedy má určité funkce i v dospělosti. Je například známo, že reelin se účastní nejen migrace neuronů a diferenciace struktur, ale i synaptogeneze.

Reelin jako ligand pro membránové receptory migrujících buněk

Postižení mozku myší „vrávoralek“ ukazuje, že nezbytnou podmínkou fyziologické výstavby mozkových struktur je fyziologická produkce reelinu buňkami jednoho typu a následná interakce mezi reelinem a neurony jiných typů, které ho ovšem – a to je důležité – samy nevytvářejí. Reelin se normálně exprimuje ve vnější marginální zóně, a není přítomen v korové ploténce. Reelin určuje migrujícím neuronům konečné místo jejich pohybu. Migrujících neurony, které postupně pronikají do korové ploténky a usazují se tam, stejně jako Purkyňovy buňky mozečku, neurony nucleus olivaris inferior, neurony jader hlavových nervů a další, s reelinem interagují svým budoucím dendritickým koncem, který už v tomto období mají opatřený membránovými receptory pro reelin.

Reelinové receptory jsou dvojí – jedny patří do rodiny protokadherinů, druhé do rodiny lipoproteinových receptorů.

Kadheriny

Protokadheriny (Pcdha) jsou spolu s klasickými kadheriny E, N, R a P, s desmogleiny, desmokoliny a dalšími příbuznými proteiny členy velké superrodiny lidských kadherinů. V centrálním nervovém systému se vyskytují jak klasické kadheriny, tak protokadheriny. N-kadherin se přechodně exprimuje při vývoji korové ploténky, ale postnatálně přetrvává jen v nejhlubších vrstvách kůry. V dospělém mozku se kadheriny i protokadheriny hojně nalézají ve specializovaných strukturách, zejména v synaptických spojeních.

Klasické kadheriny jsou transmembránové proteiny s vícečetnými tandemově uspořádanými N-koncovými ektodoménami. Molekula kadherinu jedné buňky váže jednou ze svých ektodomén kadherin plazmatické membrány sousední buňky, takže s ní vytváří homofilní (homotypickou) vazbu. Pro vznik této vazby jsou nutné extracelulární ionty Ca²⁺ (odtud název kadherinů – kalciem regulované adhezní receptorové molekuly). Aminokyselinové variace extracelulárních domén zajišťují velkou potenciální různorodost a specializaci jejich kontaktů.

Naproti tomu C-koncové endodomény všech kadherinů jsou vzájemně vysoce homologní, což souvisí s jejich shodnou funkcí. C-koncové domény se prostřednictvím tzv. spojovacích proteinů ukotvují na cytoplazmatická aktinová filamenta, a tak přenášejí variabilní napětí mezibuněčných kontaktů na cytoskelet uvnitř buňky. Charakteristická přítomnost variabilní (extracelulární) a konstantní (intracelulární) strukturní části v molekule staví adhezivní proteiny kadherinové superrodiny do blízkosti imunoglobulinů a receptorů T-lymfocytů.

Spojovacími proteiny kadherinů uvnitř buněk jsou signální molekuly kateniny – α- a β-katenin. Cytoskeletální systémy se prostřednictvím kadherinů a kateninů propojují z buňky do buňky, čímž vzniká nejen pevná mechanická, ale i jednotná signalizační soustava tkání. Vazba β-kateninu na endodoménu kadherinů v místě buněčné adheze omezuje přesun β-kateninu do buněčného jádra, kde by jinak přímo interagovala s transkripčními faktory (např. Tcf) a spustila genovou expresi (signalizační větev β-katenin-Tcf je článkem fylogeneticky staré morfogenetické cesty Wnt).

V cytoplazmatické signalizaci v nervových buňkách se také uplatňuje interakce mezi β-kateninem a cyklin-dependentní kinázou 5 (p35/Cdk5). Aktivní p35/Cdk5 oslabuje vazbu mezi β-kateninem a N-kadherinem, a podílí se na tak uvolnění kadherinových adhezních spojů mezi buňkami. To je nezbytné pro správné zakončení migrace (viz níže).

S β-kateninem také interaguje produkt genu familiální adenomatózní polypózy tračníku – protein APC, lokalizovaný v cytoplazmě na plus-koncích mikrotubulů, které směřují k buněčné membráně neuronu (svými minus-konci se mikrotubuly obracejí do buněčného těla). Signální dráha Cdk5 a dráha APC-β-katenin se vzájemně ovlivňují.

Protokadheriny

Mez protokadheriny byly jako první podrobněji studovány proteiny rodiny myších protokadherinů CNR (CNR 1-8; cadherin-related neuronal receptors 1-8). V lidském mozku je obdobou této rodiny rodina Pcdha (Pcdha1-15; protocadherins a1-15). Myší CNR a lidské Pcdha se svými variabilními vícečetnými N-koncovými extracelulárními vazebnými moduly podobají klasických kadherinům. Tyto moduly jim ale nejen umožňují vytvářet homofilní vazby s jinými protokadheriny, ale také vstupovat do heterofilních vazeb.

Extracelulární doména protokadherinových molekul s číslem 1 (EC1) slouží heterofilní vazbě s reelinem. Tato doména je ve vysoké míře konzervována, a to jak mezi všemi druhy suchozemských obratlovců, tak vnitrodruhově. Buňky, které exprimují protokadheriny rodiny CNR, neexprimují reelin. Obráceně, buňky, které syntetizují reelin, nejsou vybaveny protokadheriny CNR, popř. Pcdha. Výskyt reelinu a exprese jejich protokadherinových receptorů (CNR, Pcdha) tak jsou vzájemně komplementární. Protokadheriny tudíž nejsou přítomny v marginální zóně, obsazené Cajalovými-Retziusovými buňkami, ale jsou přítomny ve vlnách buněk generovaných při centrálním kanálku a postupně kolonizujících korovou ploténku.

Pokud jde o C-koncové cytoplazmatické domény protokadherinů, jsou opět uvnitř každé rodiny protokadherinů pozoruhodně uniformní a vysoce konzervovány jak v mezidruhových, tak v nitrodruhových měřítcích. Nepodobají se ale cytoplazmatickým doménám kadherinů ani jiných skupin proteinů kadherinové superrodiny. Intracelulární endodomény myších CNR, které vážou reelin a odpovídají lidským Pcdha, totiž na rozdíl od endodomén klasických kadherinů neinteragují s β-kateninem, ale s intracelulární tyrosinovou kinázou Fyn, členkou rodiny proteinů Src (Rous sarcoma virus protein), která dále interaguje se svými cílovými proteiny, mezi jinými i se signálním proteinem Dab1 (Disabled-1).

Kináza Fyn se exprimuje v buňkách korové ploténky. Absence Fyn způsobuje strukturní a funkční poruchy v CNS, nevede však k plně manifestovanému fenotypu reeler. K téměř plně manifestovanému fenotypu reeler však může vést současné postižení kinázy Fyn a kinázy Src, což naznačuje, že k plné aktivaci proteinu Dab1 je nejspíše zapotřebí souhry obou těchto kináz.

Kadheriny i protokadheriny jsou ideální nástroje pro vývojovou segregaci neuronů. Mohou se uplatňovat nejen při adhezi neuronů na okolní buněčné elementy a mezibuněčnou hmotu, ale i při cíleném růstu nervových výběžků, které jsou na své cíle naváděny signály v okolí. Příslušníci kadherinové superrodiny mohou svými variabilními ektodoménami zajišťovat homofilní i heterofilní spoje mezi odlišnými korovými neurony, a pokrývat tak potřebnou různorodost extracelulárních kontaktů v nervové tkáni. Jejich uniformní endodomény zároveň představují delikátní nástroj specifického kódování cest signálů uvnitř buněk.

Lipoproteinové receptory reelinu

Další receptory reelinu, receptor VLDL (VLDLR) a receptor ApoE typu 2 (ApoE-R2), jsou členy nevelké rodiny lipoproteinových receptorů, která dále zahrnuje receptor LDL (LDLR), protein příbuzný LDL-receptoru (LRP) a megalin. VLDLR i ApoE-R2 jsou fyziologickými složkami membrán neuronů.

Připomeňme si, že nejznámějším ligandem VLDLR a ApoE-R2 je apolipoprotein E (ApoE). Přestože se tento protein exprimuje v mozku, pravděpodobně v gliových buňkách, jeho izolovaný defekt nevede k výrazným morfologickým vývojovým poruchám CNS. S tím kontrastuje skutečnost, že pokud jsou oba receptory VLDLR a ApoE-R2 postiženy současně, poskytují abnormální fenotyp reeler. To ukazuje, že oba lipoproteinové receptory neinteragují jen s ApoE, ale že také jsou vstupními membránovými články reelinové signalizační kaskády.

Dab1

Reelin podobě jako po své vazbě na kadherin aktivuje také po vazbě na lipoproteinové receptory tyrosinovou kinázu Fyn anebo i jiné kinázy rodiny Src, a tím stimuluje fosforylaci tyrosinů molekuly Dab1 (Disabled-1). Fosforylovaný Dab1 jednak interaguje s cytoplazmatickými doménami samotných receptorů VLDR a Apo-R2, jednak může interagovat s níže položenými kinázami Src a Abl.

Dab1 je místem konvergence, společnou křižovatkou signálních cest souvisejících s reelinem. U myší reeler se Dab1 exprimuje v nadbytku a zůstává v hypofosforylovaném stavu. To napovídá, že fosforylace Dab1 funguje jako prostředník signálu reelinu. V této souvislosti je mimořádně významné, že aktivovaná reelinová signalizační kaskáda inhibuje cyklin-dependentní kinázu 5 (Cdk5), jejíž činnost bude popsána níže. V signální kaskádě reelinu níže po proudu pak ještě funguje cytoplazmatický protein asociovaný s mikrotubuly (MAP) zvaný DCX (doublecortin, jinak také double anebo lissencephalin X).

Postižení mozku při defektech Dab1

Knock-out myši Dab1 (-/-) mají patologický fenotyp velmi blízký fenotypu reeler. Jejich kůra má abnormální uspořádání „zevním dovnitř“. Stejně jako u fenotypu reeler není u Dab1 (-/-) přítomno štěpení pre-ploténky – na rozdíl od defektů Cdk5 anebo p35  (jak uvidíme níže). To ukazuje, že Dab1 je v reelinové signální kaskádě umístěn velmi blízko membránovým receptorům reelinu, a nad Cdk5.

Variace myšího genu Dab1 odpovídají za přirozené autosomálně recesivní mutanty zvané scrambler a yotari (to scramble ve významu namáhavě lézt po čtyřech, hrabat se; japonské yotari pak odpovídá anglickému tottering – klopýtající, potácející se).

Cyklin-dependentní kináza 5

Cyklin-dependentní kináza 5 – p31^Cdk5 – je strukturně blízká mitotické p34^Cdk1. Mezi ostatními cyklin-dependentními kinázami (Cdk) je výjimečná tím, že buňky, v nichž je její aktivita nejvyšší, jsou neproliferující (post-mitotické) diferencující se anebo už diferencované neurony. Spíše než pro buněčné dělení, jak je obvyklé pro ostatní Cdk, je zřejmě Cdk5 důležitá pro diferenciaci a činnost zralých neuronů. Podílí se především na regulaci dynamiky složek cytoskeletu. Tím ovlivňuje adhezní, migrační a sekreční pochody neuronů, tedy procesy, které mají co dělat se změnou tvaru buněk a s jejich pohyby. Cdk5 se uplatňuje při konečné morfologické a funkční diferenciaci nervových buněk, při jejich migraci, konečném umístění v centrálním nervovém systému (CNS), v plastičnosti neuronů, v růstu jejich axonů, tvorbě synapsí a v uvolňování mediátorů přes synaptickou membránu. Dále se účastní pochodů degenerace anebo programované smrti neuronů.

Katalytická jednotka Cdk5 je v mozku přítomna od raných embryonálních stádií. Enzym se ale stejně jako ostatní Cdk aktivuje až vytvořením komplexu s regulační podjednotkou. Další zvláštností Cdk5 ale je, že její regulační podjednotkou není cyklin, nýbrž aktivační protein p35 nebo aktivační protein p39. Heterodimer p35/Cdk5 působí po svém vzniku katalyticky, aniž by – jako většina ostatních Cdk – vyžadoval fosforylaci jinou kinázou.

Regulační protein p35 je poměrně labilní. Je štěpen proteasomy. Jeho poločas v buňkách je za normálních okolností krátký, asi 20 – 30 minut. Rozštěpení p35 zároveň znamená inaktivaci Cdk5. Druhá savčí aktivační podjednotka Cdk5, protein p39 je strukturně příbuzný proteinu p35 (57% shoda), ale jde o produkt jiného genu. Na svém C-konci obsahuje sekvenci 32 aminokyselin, kterou p35 nemá. Stejně jako p35 může být: i p39 autofosforylován svým katalytickým partnerem Cdk5.

Proteiny p35 a p39 nejsou ve svých funkcích vzájemně zaměnitelné, přinejmenším ne zcela. Protein p39 se v průběhu embryogeneze a ontogeneze exprimuje později než p35. Plní speciální funkce v určitých částech nervové soustavy anebo v některých stádiích vývoje mozku. Zatímco koncentrace p35 se v embryonální době zvyšuje ve stádiu tvorby korové ploténky, p39 se v největší míře hromadí v postnatálním cerebellu. Stejně jako p35 je i p39 lokalizován v růstových zónách axonů a v lamelovitých a prstovitých výběžcích membrán, kde je vázán na složky cytoskeletu.

V potkanním mozku probíhá intenzívní syntéza mRNA p35 i p39 už v časných vývojových stadiích, ale zpočátku se koncentruje v zevní plášťové zóně a při vývoji kůry pak v marginální a korové zóně, zatímco ve ventrikulární zóně chybí. To ukazuje, že regulační podjednotky se začínají exprimovat teprve v buňkách, které opouštějí zónu proliferace a dále se už nedělí (postmitotické neurony). Postmitotické neurony ovšem nezůstávají na místě, ale migrují. Usazují se v definitivních strukturách a tam pak dokončují svou morfogenezi; jejich výběžky spolu vytvářejí první axonové svazky.

Během intrauterinního vývoje aktivita Cdk5 v kůře mozku savců stále roste a po narození už neklesá. I to je v souladu s předpokladem, že Cdk5 plní své hlavní role v diferencujících se anebo terminálně diferencovaných neuronech. Podobné závislosti lze pozorovat i při vývoji cerebella a retiny. Změny aktivity Cdk5 v mozku jsou provázeny změnami koncentrací ostatních Cdk, cyklinů a přirozených peptidových inhibitorů cyklin-dependentních kináz.

Postižení mozku při defektu Cdk5

Mozek myši s úplným defektem genu cdk5 (knock-out cdk5 -/-) je poznamenán rozsáhlými vývojovými vadami. Aktivní Cdk5 je naprosto nezbytná pro vznik uspořádaných vrstevnatých struktur šedé hmoty v mozku, zejména šestivrstvé mozkové kůry. Připomeňme si, že vrstvy kůry vznikají v zárodečné korové ploténce postupným usazováním neuronů, které sem přicházejí ve vlnách. Za normálních okolností pronikají vlny nových, mladších neuronů už staršími, usedlými vrstvami neuronů předchozích vln, a umisťují se stále blíže k povrchu mozku. Vytváří se uspořádání „vnitřním navenek“ („inside-out“). Mozek cdk5 (-/-) postižené myši ale vypadá jinak. Pre-ploténka se ještě diferencuje fyziologicky. Vcestuje do ní první vlna neuronů, která by v budoucnu měla být vrstvou VI (přesněji řečeno, vrstvou VIb) kůry, a tento zárodek korové ploténky ještě rozštěpí pre-ploténku na definitivní marginální zónu a sub-ploténku. Další, mladší vlny neuronů však už při deficienci Cdk5 sub-ploténkou neprojdou a zůstanou v hloubce, pod VI. vrstvou a pod sub-ploténkou. Zde se pak ukládají shora dolů vrstvy V – II. Vytváří se patologické uspořádání „zevním dovnitř“ („outside-in“). Je narušen nejen vývoj kůry mozku, ale i vývoj cerebella, mozkového kmene a míchy (nepřítomnost foliace, kůře cerebella chybí normální vrstva Purkyňových buněk, jsou přítomny abnormálně utvářené anebo atopické struktury šedé hmoty, jsou známky degenerace neuronů atd.).

Mozková kůra myší s úplným defektem aktivačního proteinu p35 (-/-) se taktéž utváří abnormálně, ale vcelku je postižení mozku menší než u myší s cdk5 (-/-). Vysvětlení nejspíše spočívá v tom, že cdk5 může plnit část svých diferenciačních funkcí v komplexu s alternativním aktivačním proteinem p39 anebo případně s dalšími, dosud neznámými proteiny. Výsledkem defektu p35 (-/-) je nicméně opět výše zmíněné atypické uspořádání „zevním dovnitř“. Méně postiženo je vyzrávání hippokampu a cerebella.

Nervová tkáň cdk5 (-/-) anebo p35 (-/-) zvířat nápadně připomíná modely reeler anebo Dab1. Přesto je patrné, že oproti fenotypu reeler, kde ke štěpení pre-ploténky vůbec nedochází, se při deficienci Cdk5 ještě normálně utváří zárodek definitivní korové ploténky, který oddělí marginální zónu od sub-ploténky. Po morfologické stránce je tedy při absenci Cdk5 porucha CNS mírnější. Přesto myši Cdk5 (-/-) umírají dříve (prenatálně anebo časně perinatálně) než myši reeler, které přežívají nějakou dobu po narození.

Účast poruch reelinové kaskády na vzniku vrozených vývojových vad lidského centrálního systému

Přestože není známa žádná tak rozsáhlá malformace lidského mozku, která by byla srovnatelná s myšími fenotypy reeler, scrambler, yotari, Dab1 (-/-), cdk5 (-/-), p35 (-/-) anebo p39 (-/-), mohou být poznatky získané při studiu myších modelů užitečné pro interpretaci některých vývojových vad CNS člověka.

Jedna skupina vývojových vad migrace neuronů v lidském CNS je spojena s mutacemi genů LIS1 a DCX a zřejmě souvisí s poruchami funkce mikrotubulů. Jejich defekty jsou spojeny s lisencefalií typu I (lisencefalie Miller-Diekerova typu). Lisencefalie se manifestuje hladkým mozkem bez závitů a dalšími klinickými nálezy. Gen LIS1 kóduje protein LIS1, tj. B-podjednotku acetylhydrolázy destičkového aktivačního faktoru PAFAH1B1 (platelet-activating factor acetylhydrolase 1B subunit). Defekt proteinu DCX (doublecortin, jinak také double anebo lissencephalin X, XLIS), který je kódován genem DCX, se projevuje podobně. Jak produkt LIS1, tak DCX patří ke skupině proteinů MAP (microtubule-associated proteins), které jsou nezbytné pro mikrotubulární funkce. LIS1 ovládá funkce hybných proteinů dyneinu a dynektinu.

Další relevantní vývojová vada má podobu ostrůvků ektopické šedé hmoty perzistujících v blízkosti stěn komorového systému. Nazývá se periventrikulární nodulární heterotopie vázaná na chromozom X. Odpovídá za ni mutace genu kódujícího protein filamin 1 (FLN1). FLN1 (též FLNA anebo protein ABP-280) je v buňce potřebný pro vytváření příčných můstků mezi jednotkami aktinu. Zřejmě se účastní přestavby aktinového cytoskeletu a pohybů buněk – procesů, jejichž nedotčenost je nezbytná, mají-li neurony bezchybně opustit periventrikulární zárodečnou zónu. Cdk5 se významně podílí na řízení dynamiky mikrotubulů, na regulaci aktinu a neurofilament. FLN1, který obsahuje mnohočetné kopie aminokyselinových motivů fosforylovatelných Cdk5, je substrátem Cdk5.

Reelin jako STOP signál migrujícím neuronům

V limitní marginální zóně na povrchu mozku, která produkuje reelin, existují mezi výběžky buněk pevná mezibuněčná spojení. Není žádoucí, aby touto soudržnou vrstvou pronikaly další buněčné elementy. Mezibuněčná spojení jsou stabilní, a migrující mladé neurony proto nemohou oddělit buňky reelinové vrstvy jednu od druhé. K žádnému prostupu zde už nedochází. Reelin určuje migrujícím neuronům jejich konečné místo migrace.

Situace je poněkud jiná v hloubce, ve větší vzdálenosti od reelinové vrstvy. Normální migrující postmitotické neurony exprimují p35, a proto obsahují aktivní p35/Cdk5. Aktivní p35/Cdk5 v nepřítomnosti reelinu ruší interakci mezi β-kateninem a N-kadherinem. Tím se rozpojují mezibuněčné adheze, které N-kadherin zprostředkovává, a narušuje se soudržnost buněčných vrstev. V důsledku tento efekt umožňuje mladým vlnám neuronů projít sub-ploténkou a potom i korovou ploténkou z hlubších vrstev nervové tkáně až k povrchu mozku. Pokud p35/Cdk5 funguje normálně, pokračují vlny neuronů v pohybu skrze rozvolněné buněčné vrstvy až k vrstvě reelinu těsně pod definitivní marginální zónu. Tam se ovšem na jejich receptory naváže reelin. Výsledkem této vazby je inhibice p35/Cdk5. Ta rázem přerušuje rozvolňování adhezních spojů, a tím se zablokuje další postup neuronů. Proces migrace se završí. Kortikální ploténka získá definitivní vrstevnatou podobu „vnitřním navenek“.

Zatímco schopnost produkovat reelin je nezbytná pro štěpení pre-ploténky první vlnou migrujících neuronů (oddělení budoucí vrstvy I od budoucí vrstvy VI), aktivní p35/Cdk5 je naprosto nepostradatelná v následujících stádiích kortikogeneze, kdy další vlny neuronů musí proklouznout vrstvami už přítomných buněk sub-ploténky a korové ploténky. V Cdk5 (-/-) anebo p35 (-/-) se nemůže rozvolnění N-kadherinových kontaktů, popsané v předchozím odstavci, realizovat, takže nově příchozí vlny V-II nemohou proniknout skrze subploténku a korovou ploténku, a zůstávají pod nimi. Tím je vysvětlen vznik patologického uspořádání „zevním dovnitř“. Defekty tvorby reelinu anebo Dab1 (fenotypy reeler, scrambler a yotari) jsou ovšem z morfogenetického hlediska hlubší, protože při nich nemůže dojít ani ke štěpení pre-ploténky.

„Pozitivní selekce“ neuronů?

Z uvedeného vyplývá, že reelin má dvě důležité funkce. Za prvé, umožňuje štěpení pre-ploténky. Za druhé, hraje úlohu signálu STOP při radiální migraci neuronů. Zastavuje jejich pohyb. Tato hypotéza byla rozvinuta v tzv. modelu pozitivní selekce neuronů. Model je obdobou selekce probíhající při zrání buněk imunitního systému. Je založen na předpokladu, že v průběhu diferenciace neuronů se exprimují různá spektra molekul protokadherinů, které prostřednictvím interakcí s reelinem determinují další osud buněk. Interakce mezi protokadheriny a reelinem determinují zejména to, zda neurony setrvají na místě, či zda budou dále migrovat. Protokadherinová signalizace může odpovídat za odpoutání migrujících neuronů od vedoucích radiálních vláken a dále za rozvoj jejich dendritického větvení, zahájení synaptogeneze a za konečnou maturaci buněk, popř. jejich apoptózu.

Širší patofyziologické souvislosti

Je namístě uvést, že Cdk5 a Dab1 také mohou interagovat s amyloidovým prekurzorovým proteinem (APP) v mozku. APP je znám jako zdroj neurotoxických mezibuněčných depozit při Alzheimerově nemoci – chorobě, jejíž výskyt je ve vysokém počtu případů předznamenán přítomností alely ApoE-ε4 v genomu nositele. Samotný apolipoprotein E (ApoE) je ligandem lipoproteinových receptorů včetně LRP a ApoE-R2. ApoE se významně uplatňuje při internalizaci amyloidu z intersticiálního prostoru do buněk, a tím jeho detoxikaci. Rovněž je zajímavé, že v mozcích myší reeler se nacházejí velká množství hyperfosforylovaného proteinu τ, který je hlavní složkou intracelulárních smotků nahromaděných v neuronech kůry mozku nemocných s Alzheimerovou nemocí. Protein τ je významným reprezentantem skupiny proteinů MAP vzpomenutých výše. Lze předpokládat, že tyto souvislosti mají patogenetický význam.

Evoluční souvislosti

Z rozdílů mezi defekty reeler (-/-) a Cdk5 (-/-) je zřejmé, že radiální migrace v embryonálním nervovém systému a následné štěpení nervové pre-ploténky jsou dva relativně samostatné děje. Ukazují na to i fylogenetické souvislosti. Nasvědčují, že zařazení Cdk5 do reelinové kaskády znamenalo nový vývojový stupeň v utváření vrstevnatých struktur v CNS.

Další poznámku zasluhuje variabilita protokadherinů. I když jsou extracelulární domény protokadherinů rodiny CNR (event. Pcdhoc), které slouží pro vazbu reelinu (doména EC1), mezi obratlovci vysoce konzervovány, výrazně se mění jejich počet. To je v souladu s faktem, že různorodost a rozvrstvení neuronů v mozcích obratlovců je velmi proměnlivé. Evoluční diverzifikaci tedy asi nemusí zajišťovat jen strukturní variabilita genů, ale mohou se na ní významně podílet i rozdíly v jejich počtu, když jejich struktury zůstávají velmi stabilní.

Shrnutí

Dospělá šestivrstvá šedá mozková kůra savců vděčí za svůj vznik několika sledům koordinovaných vln migrací nervových buněk. Buňky vznikají v zárodečné zóně při centrálním kanálu nervové trubice a odtud radiálně migruji k povrchu mozku. Jedním z kritických stupňů embryonálního vývoje kůry je formování zárodečné korové ploténky v tzv. pre-ploténce. Korová ploténka rozštěpí pre-ploténku na definitivní marginální zónu a sub-ploténku. Za normálních okolností pronikají mladší neurony sub-ploténkou a už usedlými vrstvami buněk v korové ploténce, takže nejmladší buněčné vrstvy se vždy ocitají nejblíže povrchu mozku. Vzniká uspořádání „vnitřním navenek“ („inside-out„).

Štěpení pre-ploténky vyžaduje jednak přítomnost speciálního glykoproteinu – reelinu – v nervovém intersticiu, jednak zapojení funkčních receptorů pro tento protein na povrchu samotných migrujících neuronů. Dosud byly popsány dvě skupiny reelinových receptorů – protokadheriny a lipoproteinové receptory. Poruchy funkcí reelinu se u myší manifestuji fenotypem zvaným reeler („vrávoralka“). Charakterizují ho těžké vývojové defekty šedé kůry hemisfér a dalších vrstevnatě uspořádaných struktur centrálního nervového systému. Stejný fenotyp dává i defekt signálního článku reelinové kaskády Dab1 a podobně jsou postiženy i myši strádající současnými defekty kináz Fyn a Src.

Klíčovým článkem reelinové signální kaskády, naprosto nezbytným pro vznik normálního koncentrického šestivrstvého uspořádání šedé kůry a dalších vrstevnatých struktur v mozku, je i cyklin-dependentní kináza 5. Působí v komplexu se svými aktivátory p35 nebo p39. Její aktivita vzrůstá během embryonálního vývoje a dosahuje nejvyšších hladin v centrálním nervovém systému dospělých. Na rozdíl od fenotypu reeler, který se manifestuje při absenci funkčního proteinu reelinu nebo Dab1, při defektu p35/Cdk5 ještě dojde k fyziologické diferenciaci pre-ploténky na definitivní marginální zónu a sub-ploténku. Další, mladší vlny neuronů však už do zárodečné korové ploténky neproniknou a zůstanou pod ní. Vytvoří se patologické inverzní uspořádání „zevním dovnitř“ („outside-in„) charakterizované abnormálním uložením vrstev neuronů shora dolů v pořadí V-II. V evoluci pravděpodobně znamenalo zařazení Cdk5 do reelinové signalizační kaskády nový významný stupeň diferenciace vrstevnaté šedé mozkové hmoty. Studium poruch migrace neuronů má význam pro pochopení vývojových poruch centrálního nervového systému, jako jsou modulární heterotopie šedé hmoty anebo lisencefalie.

Zpracoval: Jaroslav Veselý, Ústav patologické fyziologie LF UP v Olomouci a katedra Fyziologie a patologické fyziologie LF OU v Ostravě.